Generell ist es schon sinnvoller, wenn du mehrere Frames in eine Datei hast, weil du mit vielen kleinen Texturen die Grafikkarte nicht auslastest (von Speicherplatz her), dafür aber sehr viel mehr Texturen pro Spielframe auf die Grafikkarte transportierst.
Stell dir das in etwa so vor wie ein Lager, dass nie komplett voll ist, in dem aber jeden Tag mehrmals die Kisten raus und reingeschoben werden.
Die wesentlich wichtigere Frage ist hier meiner Meinung nach eher, wie du die einzelnen Frames der Animationen unterschiedlicher Charaktere etc. sinnvoll verteilst.
Bei einen Spiel mit vielen Gegnern des selben Typs, ergibt es zum Beispiel Sinn möglichst viele Animationen in einer Datei unterzubringen, da sich vermutlich jeder Gegner in einen anderen Zustand befindet (selbst wenn sie die gleiche Animation verwenden, kann ja einer bei Frame 1 und der andere bei Frame 3 sein).
Wie sieht es jedoch mit den Frames der Spielercharakters aus? Je nach Spiel kann es hier durchaus sein, dass du für diese eine Figur eine eigene Datei für alle Animationen hast. Da diese aber eh nur einmal gezeichnet wird, wäre hier mMn Einzeltexturen sinnvoller, da du die anderen Frames eh nicht auf der Grafikkarte brauchst. Noch besser wäre es natürlich, wenn du sämtliche Charaktere mitsamt Animation (oder sogar alles was gezeichnet werden muss) in einer Datei unterkriegen könntest, aber da könnte die Datei dann natürlich zu groß sein, weswegen die Grafikkarte diese nicht mehr ohne weiteres verarbeiten kann.
Überleg dir vorher also genau welche Frames häufig (oder/und zusammen) gebraucht werden, wenn du in Richtung Renderoptimierung entwicklen möchtest.
Btw: Nichts hindert dich daran für Texturen mit vielen Animationsframes zu entwickeln und hinterher doch Einzelframes zu verwenden. Du wirst vllt. 1-2 Tage an der Implementierung hängen bist aber flexibel genug um anschließend selbst zu prüfen, welcher Lösungsansatz geeignet ist.